Caractérisation des phosphorelais et des toxines chez les bactéries, par couplage photo-dissociation laser et spectrométrie de masse
Characterization of bacterial toxins and two-component systems by coupling laser-induced dissociation in the visible range with mass spectrometry

Résumé :
Au cours de ma thèse, j’ai développé et appliqué une méthode analytique innovante combinant la spectrométrie de masse à la dissociation induite par laser (LID-MS/MS) pour l’étude de protéines bactériennes. Cette approche repose sur une fragmentation sélective basée non seulement sur la masse, mais également sur les propriétés optiques des analytes. Contrairement aux méthodes de fragmentation classiques en MS/MS non-discriminants, qui fragmentent indistinctement tous les ions isobariques -rendant la détection de composés peu abondants difficile sans enrichissement dans des matrices complexes- la LID ne cible que les ions capables d’absorber l’énergie du laser. Pour une meilleure spécificité, un laser émettant à 473 nm est choisi, car les protéines naturelles n’absorbent pas dans le domaine du visible, et ne sont donc pas détectées. La photo-fragmentation des composés ciblés est obtenue après greffage spécifique d’un chromophore -le Dabcyl-, qui absorbe à 473 nm, sur les protéines d’intérêt. Cette stratégie permet donc de cibler un sous-ensemble de peptides et de réduire virtuellement la complexité de l’échantillon puisque seuls ces peptides dérivés avec le chromophore sont détectés en LID.
La première partie de mon travail de thèse s’est intéressée à Dickeya dadantii, agent phytopathogène bactérien responsable de maladies destructrices chez de nombreuses cultures maraîchères. Sa virulence repose sur sa capacité à s’adapter à des stress environnementaux via des systèmes de régulation dits « à deux composants ». Ces systèmes sont constitués d’un senseur i.e. protéine histidine kinase (HK) membranaire qui s’auto-phosphoryle sur une histidine en réponse à un stimulus environnemental, puis transfère son groupement phosphate au régulateur de réponse (RR), qui module l’expression génique en conséquence. Chez les bactéries, la phosphorylation se produit sur un résidu aspartate (pD) du RR. La clé de cette voie de signalisation réside dans le niveau de phosphorylation du RR. Or, cette phosphorylation est instable : les groupements phosphate des pD sont particulièrement labiles et difficiles à détecter. Les méthodes classiques d’enrichissement des protéines phosphorylées n’autorisent pas une mesure quantitative du taux d’occupation, car elles éliminent les formes non modifiées. Afin de pouvoir suivre cette dynamique, j’ai donc développé un protocole de dérivation spécifique des groupements pD, avec différentes sondes qui contiennent le chromophore Dabcyl et un groupement réactif hydroxylamine, afin de détecter, de façon spécifique, les peptides modifiés par LID-MS/MS sans enrichissement préalable. Les premiers tests, notamment pour déterminer la concentration en sonde et les solvants de réaction optimaux, ont été réalisés sur un TCS modèle: la protéine CpxR phosphorylée in vitro.
Dans un second temps, cette approche de photodissociation a été appliquée à la détection et à la quantification de toxines produites par Staphylococcus aureus, une bactérie pathogène opportuniste, fréquemment retrouvée dans les environnements hospitaliers et alimentaires. Ce pathogène, souvent commensal chez l’Homme, est capable de provoquer de nombreuses infections, notamment via la production d’entérotoxines (SEs). Ces toxines présentent à la fois un pouvoir émétisant élevé et une capacité à suractiver le système immunitaire, les rendant particulièrement préoccupantes en santé publique. J’ai donc développé une méthode LID-MS/MS pour la quantification de sept entérotoxines (SEA, SEB, SEC, SED, SEH, SEQ et SER), sans enrichissement immunologique préalable. Dans le but d’améliorer la sensibilité envers ces protéines mineures, un acide aminé rare et présent sur la majorité des protéines est dérivé : la cystéine. La préparation des échantillons a été optimisée en utilisant des toxines purifiées ajoutées en matrices biologiques. Enfin, le protocole analytique complet a été validé par la détection et la quantification des SEs endogènes produites par des souches de S. aureus.

Summary :
During my PhD, I developed and applied an innovative analytical method combining mass spectrometry with Laser-Induced Dissociation (LID-MS/MS) for the study of bacterial proteins. This approach enables selective fragmentation based not only on mass but also on the optical properties of analytes. Unlike conventional, non-selective MS/MS fragmentation methods -which fragments all isobaric ions indiscriminately and hinder the detection of low-abundance compounds in complex matrices without prior enrichment- LID specifically targets only ions capable of absorbing laser energy. For a better specificity, a 473 nm laser was chosen, as native peptides do not absorb in the visible range and thus remain undetected. Targeted photo-fragmentation is obtained after specific attachment of a chromophore-Dabcyl-which absorbs at 473 nm, to proteins of interest. This strategy enables the selective targeting of a subpopulation of peptides and virtually reduces sample complexity, as only chromophore-derivatized peptides are detected in LID.
The first part of my thesis focused on Dickeya dadantii, a major phytopathogenic bacterium responsible for destructive diseases in a wide range of crops. Its virulence largely depends on its ability to adapt to environmental stress through two-component regulatory systems (TCS). These systems consist of a membrane-bound sensor histidine kinase (HK), which autophosphorylates in response to an environmental signal and then transfers the phosphate group to a response regulator (RR). The RR, in turn, modulates gene expression accordingly. In bacteria, phosphorylation typically occurs on an aspartate residue (pD) within the RR. The key to understanding this signaling pathway lies in assessing the phosphorylation level of the RR. However, this phosphorylation is highly unstable: phosphate groups on pD residues are particularly labile and difficult to detect. Traditional phosphoprotein enrichment methods are incompatible with site occupancy analysis, as they remove non-phosphorylated forms during the enrichment process. To overcome this limitation and monitor the dynamics of RR phosphorylation, I developed a specific derivatization protocol for pD residues using chemical probes containing both a Dabcyl chromophore and a reactive hydroxylamine group. This enables the selective detection of modified peptides via LID-MS/MS, without prior enrichment. Initial tests to optimize probe concentration and reaction solvents were conducted using a model TCS protein: CpxR, phosphorylated in vitro.
This photodissociation approach was then applied to the detection and quantification of toxins produced by Staphylococcus aureus, an opportunistic pathogen frequently found in hospital and food environments. Though often a human commensal, this bacterium can cause various infections, notably through the production of staphylococcal enterotoxins (SEs). These toxins are of particular public health concern due to their potent emetic effect and their ability to overactivate the immune system. I developed a LID-MS/MS method to quantify seven major enterotoxins (SEA, SEB, SEC, SED, SEH, SEQ, and SER) without prior immunoaffinity enrichment. To enhance sensitivity toward these low-abundance proteins, a rare amino acid-cysteine, which is nonetheless present in most proteins- was selectively derivatized. Sample preparation was optimized using purified toxins spiked into biological matrices. The full analytical workflow was then validated by detecting and quantifying endogenous SEs produced by S. aureus strains.